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发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。C58C1发根农杆菌菌株含有pRiA4b农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（蔷薇科，夹竹桃科，豆科，茄科，黄芩，烟草等），同时具有链霉素，利福平抗性。

• 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
  
• 混匀质粒时应用手指快速拨打管底或用枪吹吸混匀，务必使质粒快速、均匀分散开，与感受态细胞充分接触。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
  
• 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量或降低涂板的菌量。
  
• C58C1具有链霉素、利福平抗性，不可用于具有链霉素抗性或利福平抗性质粒的转化。

• 取-80℃保存的C58C1发根农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
  
• 每100μL感受态加入0.01～1μg质粒DNA，用手快速、剧烈拨打管底混匀或用枪吹吸混匀，依次放于冰中静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
  
  • 转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量。
• 冰浴中拿出放室温，加入700μL无抗生素的TY液体培养基，于28℃振荡培养2小时。
  
• 6000rpm离心一分钟收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应。

• 农杆菌相关抗生素配方：
  

  抗生素	溶解	除菌	原液	工作液
  羧苄青霉素	双蒸水	0.22μm滤膜过滤除菌	50mg/mL	50μg/mL
  硫酸卡那霉素	双蒸水		50mg/mL	50μg/mL
  链霉素	双蒸水		10mg/mL	50μg/mL
  利福平	DMSO		10mg/mL	20μg/mL
  庆大霉素	双蒸水		20mg/mL	40μg/mL

  
  
• TY培养基配方：
  
  • 按下表加入各成分：
    

    成分	用量
    Tryptone	5g
    Yeast extract	3g
    水	至1L

  • 完全溶解后，121℃、20分钟高温灭菌。
    
  • 配制1M的氯化钙水溶液，121℃、20分钟高温灭菌。
    
  • 每升灭菌的TY液体营养液中加入10mL无菌的1M氯化钙水溶液即可。
    
  • 若配制TY固体培养基，则加入15g琼脂粉。